Биолюминесцентный тест на основе морских светящихся бактерий

Биолюминесцентный анализ проводили с помощью светящихся бактерий Photobacterium leiognathi Sh1, выделенных из Азовского моря и обладающих высокой чувствительностью к действию токсических факторов различной природы, а также высокой скоростью роста [145].

Изучение острого действия веществ (токсичности). Подготовку бактерий для биотестирования осуществляли следующим образом. Музейную культуру, которая хранилась на полужидком агаре под вазелиновым маслом, высевали на жидкую питательную среду. После инкубации при температуре 30 ^оС, бактерии анализировали визуально на наличие биолюминесценции. При выявлении свечения, бактерии с жидкой питательной среды высевались на твердую среду с рассевом до отдельных колоний. Для следующего пересева отбирали наиболее ярко светящуюся колонию, которую пересевали на жидкую питательную среду и использовали для проведения биотестирования.

Полученную на предыдущем этапе бактериальную культуру разводили 3 % хлоридом натрия до концентрации клеток 5-10⁵ кл/мл. Для определения острого действия (токсичности) образцов, в кюветах люминометра смешивали 0.8-0.9 мл тестируемого раствора в 2.5-3%-ом растворе NaCl, 100 мкл буферного раствора с рН=7.0 и 50 мкл бактериальной суспензии. Регистрировали изменение интенсивности биолюминесценции в течение 30120 минут с использованием самописца. Результаты представляли в виде зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации вещества по следующей формуле:

I = ^ • 100% (2.4)

1₀

где It - интенсивность биолюминесценции в присутствии вещества; I₀ - интенсивность биолюминесценции в контроле.

Хроническое действие (токсичность) определяли по эффекту тестируемого объекта на рост и биолюминесценцию светящихся бактерий. В кюветы люминометра вносили 0.8-0.9 мл 3%-го раствора хлорида натрия, 5-50 мкл тестируемого образца и 50 суспензии светящихся бактерий. После измерения биолюминесценции в пробы вносили 20-50 мкл стерильной среды для светящихся бактерий и помещали их в термостат при температуре 30 °С на 16 ч. Измерение биолюминесценции и обработку результатов проводили аналогично методике определения острого действия.

1.3.