ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Изучение совместного действия электромагнитного излучения (ЭМИ) и биологически-активных соединений (БАС) на биосистемы различного уровня организации представляет большой интерес в связи с перспективой использования комбинированного воздействия лекарственных препаратов и ЭМИ в терапии различных заболеваний.

Существуют основания полагать, что первичной мишенью нетеплового действия слабого излучения микроволнового диапазона на клеточном уровне является ядерный хроматин. Взаимодействие ЭМИ с хроматином может изменять степень электростатических взаимодействий ДНК-белок и вызывать изменение функционального состояния клеток, проявляющееся в разнообразных клеточных эффектах, регистрируемых различными методами. В связи с этим существует мнение, что ЭМИ может определенным образом взаимодействовать с БАС, механизм биологического действия которых обусловлен нековалентным комплексообразованием с ядерной ДНК. Имеющиеся свидетельства действительно указывают на наличие биологического синергизма при совместном действии слабого ЭМИ и ДНК- связывающихся препаратов, а также комбинаций препаратов в отсутствие ЭМИ, в частности при действии на пролиферирующие клеточные линии. Тем не менее, данные о подобном эффекте в непролиферирующих клеточных системах в настоящее время отсутствуют.

Связь работы с научными программами, планами, темами. Диссертационная работа выполнена согласно плану научно-исследовательских работ кафедры физики Севастопольского национального технического университета в рамках государственной бюджетной темы «Действие электромагнитного излучения на молекулярные процессы, свойства клеток и процессы оплодотворения и эмбриогенеза» («ЭМИ»), № госрегистрации 0112U008334 (2013-2015).

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось установление закономерностей в отклике клеток буккального эпителия человека на комбинированное действие слабого ЭМИ и БАС.

Для достижения данной цели решались следующие задачи:

1. разработка устройства и адаптация методики исследования электрокинетических свойств ядер методом микроэлектрофореза;

2. установление закономерностей изменения состояния хроматина и клеточной мембраны под влиянием слабого ЭМИ миллиметрового диапазона различных характеристик;

3. определение закономерностей процессов гетерохроматинизации в интерфазных ядрах, изменения показателя электроотрицательности ядер и барьерной функции мембран под действием ароматических БАС по отдельности и в комбинациях;

4. изучение закономерностей изменения состояния хроматина и клеточных ядер при совместном действии ЭМИ и ароматических БАС;

5. обсуждение молекулярных механизмов наблюдаемого клеточного отклика при комбинированном действии БАС и ЭМИ.

Объект исследования - реакция клеток буккального эпителия человека на действие слабого ЭМИ микроволнового диапазона и комбинаций ароматических БАС.

Предмет исследования - состояние хроматина и мембран, а также электрокинетические свойства ядер клеток буккального эпителия человека.

Методы исследования.

1. Метод определения степени конденсации хроматина в интерфазных ядрах клеток буккального эпителия по количеству гранул гетерохроматина при окрашивании орсеином.

2. Метод оценки изменения проницаемости мембран клеток буккального эпителия при окрашивании клеток раствором индигокармина.

3. Метод исследования электрокинетических свойств ядер с помощью клеточного микроэлектрофореза.

4. Биолюминесцентный тест на основе морских светящихся бактерий.

5. Метод спектрофотометрии в УФ и видимом диапазоне длин волн.

6. Атомно-силовая микроскопия и микроскопия в видимом диапазоне.

7. Методы статистической обработки данных.

Научная новизна полученных результатов.

В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование комбинированного действия слабого ЭМИ и ароматических БАС на клетки буккального эпителия человека.

Установлена корреляция между изменениями состояния хроматина и электроотрицательностью клеточных ядер под действием некоторых ДНК- интеркаляторов. Обнаружено концентрационно-зависимое увеличение количества гранул гетерохроматина и снижение электроотрицательности ядер при инкубации клеток буккального эпителия с препаратами от 10 мин до 3 часов.

На непролиферирующих клетках буккального эпителия впервые обнаружен синергетический протекторный эффект при исследовании комбинированного действия электромагнитного излучения с ДНК- интеркаляторами, проявляющийся в уменьшении клеточного отклика, вызываемого электромагнитным излучением и препаратами по-отдельности. Также наблюдался протекторный эффект С₆₀ фуллерена и кофеина по отношению к действию электромагнитного излучения.

При исследовании комбинированного действия биологически активных соединения на клетках буккального эпителия обнаружен протекторный эффект кофеина и С₆₀ фуллерена по отношению к генотоксическому действию ДНК- интеркаляторов. Данный эффект хорошо описывается в рамках теории интерцепторно-протекторного действия и обусловлен нековалентным комплексообразованием (гетероассоциацией) БАС друг с другом.

Существование протекторного эффекта также подтверждено на пролиферирующей клеточной культуре светящихся бактерий.

Практическое значение полученных результатов. В работе продемонстрирована возможность использования хроматина буккального эпителия человека как достаточно чувствительного объекта для качественной и количественной оценки воздействия ЭМИ и БАС на клеточном уровне. Полученные результаты также указывают на перспективу использования С₆₀ фуллерена и кофеина для уменьшения потенциально генотоксического воздействия электромагнитного излучения.

Личный вклад соискателя. Соискателем самостоятельно обрабатывались литературные источники, проведена большая часть экспериментальной работы, выполнен анализ и обобщение результатов, проведена статистическая и математическая обработка данных.

Апробация результатов диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены на VII, VIII, IX Международных научнотехнических конференциях «Актуальные вопросы биологической физики и химии (БФФХ)» г. Севастополь (2011, 2012, 2013 г.г.); в Материалах Международной научно-методической конференции «Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы» г. Воронеж (Россия) (2013 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ (из них 3 статьи индексированы в международных наукометрических базах данных).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Слабое микроволновое излучение сантиметрового диапазона вызывает статистически-значимый отклик клеток буккального эпителия человека в виде роста количества гранул гетерохроматина и увеличения проницаемости мембран для витального красителя, отражающий изменение функциональной активности клеточного ядра.

2. Введение ароматических ДНК-интеркаляторов (доксорубицина, профлавина и бромистого этидия) вызывает конденсацию хроматина и снижение электроотрицательности клеточных ядер.

3. Ароматические ДНК-интеркаляторы (доксорубицин, профлавин, бромистый этидий и кофеин) и С₆₀ фуллерен проявляют протекторный эффект по отношению к действию слабого микроволнового излучения на хроматин клеток буккального эпителия человека, заключающийся в восстановлении функциональной активности клеточного ядра.

4. Введение C₆₀ фуллерена или кофеина совместно с ароматическими ДНК- интеркаляторами позволяет уменьшить эффект, вызванной индивидуальным действием ДНК-интеркаляторов на уровне ядра и хроматина клеток буккального эпителия.

5. Экспериментальные данные изменения числа гранул гетерохроматина как функции концентрации интерцептора (C60 фуллерена или кофеина) при введении в клетку ДНК-интеркалятора хорошо описываются в рамках теории интерцепторно-протекторного действия, в основе которой лежит представление о гетероассоциации и конкуренции интеркалятора и интерцептора за места посадки на биорецептор.

Структура и объем работы. Текст диссертации включает введение, 5 глав, выводы, список использованных источников и приложение. Текст диссертации изложен на 203 страницах машинописного текста и включает в себя 44 рисунка и 9 таблиц в основном тексте, и 1 рисунок и 16 таблиц в приложении. Список литературы содержит 287 наименований.