МОЛЕКУЛЯРНАЯ САМОСБОРКА

В последние годы понятие «самоорганизация» широко используется для того, чтобы описать и объяс­нить сходные явления в физических, химических, био­логических и даже экономических и социологических системах.

Самоорганизация — это явление самопроизвольного образования структуры в различных по своей физической природе системах. Под самопроизвольным возникновени­ем структуры подразумевают появление упорядоченного состояния в изначально случайном распределении компо­нентов системы без видимого внешнего воздействия. Упо­рядоченными состояниями в общем случае могут быть со­храняющееся во времени пространственно-неравномерное распределение материальных компонентов системы; неза­тухающие колебания концентраций компонентов системы, когда они осциллируют между двумя или более значения­ми; более сложные формы упорядоченного коллективного поведения компонентов. Образование структуры одинако­во присуще как физическим устройствам типа лазеров, так и химическим реакционным средам и биологическим тка­ням, сообществам живых организмов, геологическим и метеорологическим процессам, социальным феноменам человеческого общества. Механизмы самоорганизации оказываются различными для разных по своей природе систем, но тем не менее всем им присущи некоторые об­щие структурные и динамические характеристики.

Различным по своей природе системам могут соответ­ствовать разные, нередко резко отличающиеся друг от друга уровни сложности самоорганизации.

Яркие и непротиворечивые примеры самоорганизации были обнаружены среди физических систем. Понятие са­моорганизации распространилось и на химические явле­ния, где наряду с ним достаточно широко используется термин «самосборка». А в биологии самоорганизация на протяжении второй половины XX века сделалась цен­тральным понятием при описании динамики биологиче­ских систем, начиная с внутриклеточных процессов и до эволюции экосистем. Таким образом, самоорганизация представляет собой явление междисциплинарного харак­тера и принадлежит к области знаний, которую обычно называют кибернетикой или более узко — синергетикой.

Любой конкретный процесс самоорганизации основан на некотором дуализме. С одной стороны, самоорганиза­ция системы осуществляется конкретными физическими, химическими или какими-то иными механизмами. С дру­гой — для того чтобы система была самоорганизующейся, необходимо выполнение общих для всех самоорганизую­щихся систем кибернетических условий — общих прин­ципов самоорганизации.

1. Процессы самоорганизации возникают в распреде­ленных динамических системах. Распределенная систе­ма должна представлять собой совокупность большого числа отдельных компонентов, элементов, составляющих систему. К ним могут относиться отдельные молекулы в химических реакционно-диффузионных системах, особи в косяке рыб, отдельные люди в толпе, собравшейся на площади. Эти компоненты должны взаимодействовать друг с другом, т.

2. Важная особенность процессов самоорганизации заключается в том, что они осуществляются в открытых системах. В термодинамически замкнутой системе эво­люция во времени приводит к состоянию равновесия с максимальным значением энтропии системы. И, соглас­но Больцману, это состояние с максимальной степенью хаотичности.

3. В системе должны проявляться положительные и отрицательные обратные связи. Процессы, протекающие в динамической системе, стремятся изменить исходные соотношения между вовлеченными в эти процессы ком­понентами системы. Это условно можно назвать измене­ниями на выходе системы. В то же время эти компоненты являются исходными для протекающих в системе процес­сов, они являются и параметрами на входе в систему. Если изменения на выходе системы влияют на входные парамет­ры так, что изменения на выходе усиливаются, это называ­ется положительной обратной связью. Под отрицательной обратной связью подразумевается ситуация, когда дина­мические процессы в системе поддерживают постоянное состояние на выходе. В общем случае динамические сис­темы с положительными и отрицательными обратными связями моделируются нелинейными дифференциальны­ми уравнениями. Это является отражением нелинейного характера систем, способных к самоорганизации, — ос­новного, по-видимому, свойства системы, определяюще­го ее способность к самоорганизации.

Понятие «самосборка» имеет химическое происхож­дение. Его ввел в 1987 году французский химик Ж.-М. Лен для того, чтобы выделить среди многочисленных явлений самоорганизации процессы самопроизвольного структуро- образования в системах, которые находятся в состоянии термодинамического равновесия. Действительно, извест­но большое число таких процессов структурообразования в равновесных, а точнее близких к равновесию услови­ях. Среди них, например, переходы «спираль-клубок» в полимерных молекулах, образование надмолекулярных структур амфифильных молекул (мицеллы, липосомы, бислои) и т.

Самосборкой называют процесс, при котором из от­дельных компонентов или составляющих смеси благода­ря минимизации их общей энергии образуется самопро­извольно упорядоченное единое целое (агрегат). В природе конечная конформация огромного числа макромолекул (та­ких, как белки, мицеллы, липосомы и коллоиды) форми­руется посредством самосборки в процессе фолдинга. Име­ется много примеров естественной самосборки, самопро­извольно происходящей под воздействием природных сил. Такие природные самосборки наблюдаются на всех уров­нях (от молекулярного до макромолекулярного) и в раз­личных системах живой материи.

Самосборка в нанотехнологии охватывает широкий круг понятий и способов усложнения структуры, начиная от выращивания кристаллов до создания совершенных биологических организмов. С помощью природных меха­низмов при таких самосборках можно формировать и соз­давать различные наноструктуры и далее более крупные системы и материалы с требуемыми физико-химически­ми свойствами. Укрупненные неоднородные агрегаты должны быть пригодны для выполнения различных слож­ных функций или создавать новые формы материалов с необычными свойствами.

Осуществление направляемой самосборки требуемых искусственных наноструктур из молекулярных «строи­тельных» блоков — основная задача нанотехнологии. Ра­зумеется, для ее решения необходимо использовать сведе­ния о межмолекулярном взаимодействии между молеку­лярными «строительными» блоками, пространственном расположении наноструктур, результаты компьютерного молекулярного моделирования, а также данные бионики. Под бионикой подразумевают получение на основе струк­тур и функций биологических субстанций искусственных объектов, имитирующих природные системы.

Самосборка является основным процессом (или дви­жущей силой), который привел от неживой материи к эво­люции биологического мира.

Успех самосборки предопределяют пять факторов:

1. Наличие молекулярных «строительных» блоков. Наибольший интерес для нанотехнологии представляют самосборки молекул больших размеров, в диапазоне от 1 до 100 нм. При этом чем более крупными и хорошо струк­турированными являются исходные молекулярные «строи­тельные» блоки, тем более высок уровень технического контроля за остальными молекулами и их взаимодейст­виями, что значительно облегчает процесс самосборки. В качестве наиболее универсальных и перспективных ка­тегорий молекулярных «строительных» блоков могут рассматриваться алмазоиды — углеводороды, в которых атомы углерода образуют тетраэдральную пространствен­ную решетку, точно такую же, как и в алмазе (адаманта- ны, диамантаны и триамантаны).

2. Межмолекулярные взаимодействия. Обычно силы, обеспечивающие самосборку, определяются слабыми не­ковалентными межмолекулярными связями: электроста­тическими и водородными связями, ван-дер-ваальсовыми, полярными, гидрофобными и гидрофильными взаимодей­ствиями. Совместимость отдельных частей и стабильность всего комплекса самосборки обеспечивается большим чис­лом таких слабых взаимодействий для конформации ка­ждого молекулярного участка. Примером стабильной са­мосборки, построенной при слабых взаимодействиях, яв­ляется структура белков.

3. Обратимость процесса. Существующие, а также предполагаемые самосборки в нанотехнологии являют­ся управляемыми, но самопроизвольными процессами, в ходе которых молекулярные «строительные» блоки объ­единяются в требуемые упорядоченные сборки или ком­плексы. Чтобы такой процесс был самопроизвольным, он должен осуществляться обратимым путем.

4. Обеспечение подвижности молекул. Из-за динами­ческой природы процесса самосборки для его осуществле­ния необходима жидкая среда. Возможная для использо­вания внешняя среда может включать: жидкости, газы, флюиды в сверхкритическом состоянии, межфазные гра­ницы между кристаллами и жидкостями со стороны жид­кой фазы и т. п. Во всех этих случаях во время самосбор­ки должны происходить динамические обменные процес­сы в направлении достижения минимального значения энергии системы.

5. Среда протекания процесса. На самосборку значи­тельное влияние оказывает окружающая среда. Образую­щийся молекулярный агрегат представляет собой упоря­доченное множество частиц, которое имеет термодинами­чески наиболее устойчивую конформацию. Самосборка происходит в жидкости и газообразной среде (включая сре­ду «плотный газ — сверхкритический флюид»), вблизи межфазной границы между кристаллом и флюидом или на поверхности раздела между газом и жидкостью.

На каждой стадии сборки по крайней мере один ком­понент должен свободно диффундировать в растворителе, чтобы найти специфический, только ему предназначен­ный центр связывания после обследования всех возмож­ных положений и ориентаций. Для этого необходимо, что­бы компонент был растворим, имел поверхность, компле­ментарную поверхности своего специфического центра связывания, и чтобы все остальные поверхности заготов­ки и компонента были некомплементарны для предотвра­щения их устойчивого связывания. Указанные парамет­ры дополняют функциональные требования: для форми­рования сложных структур с помощью самосборки более всего подходят материалы и рабочие среды в естествен­

ных условиях. Этот процесс с успехом применяется в суп- рамолекулярной химии, он также широко используется для управления молекулярной кристаллизацией.

Рассмотрим методологию самосборки. Имеется два ее вида, которые основаны на двух процессах, происходя­щих, во-первых, на поверхности раздела между жидкой и твердой фазами и, во-вторых, внутри флюидной фазы. За флюидную фазу можно принимать жидкость, пар или плотный газ (в сверхкритическом состоянии).

Существует ряд лабораторных способов самосборки, использующих флюидную среду в качестве внешней для ассоциации молекул, а твердую поверхность в качестве основы для нуклеации и роста.

Фиксация молекул в качестве затравок для сборки на твердых подложках, применяемых для самосборки, мо­жет осуществляться при образовании ковалентных или нековалентных связей между молекулой и поверхностью. Первые обусловливают необратимую и, следовательно, ус­тойчивую фиксацию на всех стадиях сборки. Фиксация с помощью вторых — обратимый процесс, в начале которо­го она нестабильна, однако становится устойчивой при со­ответствующем развитии процесса самосборки.

Ковалентной связью, чаще других используемой для фиксации, является связь сульфида с благородным метал­лом. Один из таких примеров — ковалентная связь между тиолсодержащими молекулами (такими, как алкантиоло- вые цепочки или белки, содержащие цистин в структуре) и золотом. Типичные нековалентные связи, используемые для фиксирования, включают следующие три вида свя­зывания: 1) за счет энергии сродства к антителам; 2) за счет энергии сродства с помощью системы биотин-стреп- тавидин и ее модификации; 3) комплексообразование с фиксированными ионами металлов.

Большое практическое значение представляет само­сборка монослоя. Согласно определению монослой, полу­ченный в результате самосборки, — это двухмерная плен­ка толщиной в одну молекулу, которая образует ко­валентные связи с твердой поверхностью. Самосборка монослоя широко используется в нанотехнологии, в том

числе в нанолитографии, при моди­фицировании адгезионных свойств и характеристик смачивания по­верхностей, в разработке химиче­ских и биологических сенсоров, изолирующих слоев в микроэлек­тронных схемах и изготовлении наноприборов и др.

Рассмотрим различные спо­собы самосборки монослоя белка (рис. 6.14).

1. Физическая адсорбция. Дан­ная методика основывается на ад­сорбции белков на таких твердых поверхностях, как угольный элек­трод, оксид металла или кремния. Адсорбированные белки образуют самособирающийся монослой с бес­порядочно ориентированными бел­ками. Контроль ориентационных характеристик можно улучшить с помощью модификации белка и самой поверхности, что показано на рис. 6.14а.

2. Включение полиэлектроли­тов или проводящих полимеров, которые могут служить матрицей, поверхность которой захватывает, закрепляет и адсорбирует белки. Этот процесс показан на рис. 6.146.

3. Включение в самособираю­щийся монослой алкантиоловых цепочек создает похожий на мем­брану монослой на благородном ме­талле, при этом белки могут быть физическая адсорбция (а); вкрапление протеинов в полиэлектролиты или проводя­щие полимеры (б); вкрапление в ССМ (в); присоединение к ССМ с неориентирован­ным расположением (г); присоединение к ССМ с ориентированным расположени­ем (д); прямое сайт-специфическое присоединение к поверхности золота (е).

расположены без какой-либо определенной ориентации. Если использовать цепочки разной длины (создание вмя­тин и ямок), то это обусловит определенную топографию самособирающегося монослоя, которая, в свою очередь, может ориентировать белки (рис. 6.14в).

4. Неориентированное присоединение к самособираю- щемуся монослою. В данном случае у цепочек, образую­щих самособирающийся монослой, на концах имеются функциональные группы, которые неспецифическим об­разом реагируют с разными участками белка. По этой при­чине ориентация белков носит случайный характер, что изображено на рис. 6.14г.

5. Ориентированное присоединение к самособирающе- муся монослою. Принципы сборки такие же, как и в пре­дыдущем случае, но здесь функциональная группа спе­цифически взаимодействует только с определенным до­меном или участком данного домена, и, следовательно, осуществляется четко выраженная ориентация. С этой целью структура белков может быть химически или ге­нетически модифицирована. Данный способ самосборки изображен на рис. 6.14д.

6. Прямое избирательное присоединение к золоту. Это происходит при связывании цистина, обладающего уни­кальными свойствами, с поверхностью золота. В данном случае ориентация полностью контролируется. Такой ва­риант присоединения показан на рис. 6.14е.

Самосборка, направляемая воздействием деформации, применяется при изготовлении и соединении проводов и переключателей. Поверхность с литографически задан­ным рельефом пропитывается осаждаемым веществом контролируемого состава в условиях возникновения де­формации. В подложку можно ввести функциональную группу, которая обычно ассоциируется с функциональны­ми возможностями поверхности. Этот способ самосборки может использоваться, например, при создании полупро­водниковых устройств, где требуется фиксировать ком­поненты системы на твердой подложке, чтобы полностью контролировать протекание процесса самосборки и его за­вершение.

Рис. 6.15 Схема ДНК-направляемой сборки

ДНК можно использовать как для избирательной по узлу фиксации, так и в качестве связующего вещества, в результате появляется решеточный каркас для самосбор­ки наноструктур. Синтез конъюгата нуклеиновой кислоты и белка с использованием специфических взаимодействий между двумя комплементарными нитями ДНК, антигеном и антителом, между БИО и СТВ может обусловливать эф­фективные механизмы, определяющие направление при­соединения наноструктурных модулей (рис. 6.15).

Недавние успехи генной инженерии, достигнутые в методах воздействия на последовательности ДНК, фикси­руемые на поверхности золота, подобно легированию, еще больше увеличивают контроль над процессом самосбор­ки. Подобный метод можно применять в случае молекул неорганических веществ, достигающих размеров нанок­ристаллов. ДНК также можно использовать для синтеза с участием темплетов. Примером такого синтеза является изготовление нанопроводов из серебра при использовании ДНК в качестве основы.

Эффективным способом открытия перспективных со­единений и самосборок является применение достиже­ний динамической комбинаторной химии, которая пред­ставляет собой эволюционный подход к нанотехнологии «снизу вверх». Для разработки структуры динамической

комбинаторной химии необходимо собрать динамическую комбинаторную библиотеку промежуточных компонентов, которые при добавлении шаблонов образуют требуемую мо­лекулярную сборку. В динамической комбинаторной хи­мии важным компонентом является механизм распознава­ния молекул. Дополнением является знание особенностей создания комплексов «гость-хозяин».

В настоящее время комбинаторная химия использует­ся как метод теоретического исследования при установле­нии структурных основ функции ферментов и идентифи­кации новых ингибиторов энзимов. Полагают, что с ее по­мощью возможен потенциально быстрый выход на новые самосборки в нанотехнологии, а также на открытие но­вых лекарственных препаратов, супрамолекулярных ан­самблей и катализаторов.

Существует два вида комбинаторной химии: традици­онная и динамическая (рис. 6.16). Основное различие ме­жду ними состоит в том, что в динамической химии мо­лекулярные «строительные» блоки соединяются вместе слабыми, но обратимыми нековалентными связями, в то время как в традиционной комбинаторной химии взаимо­действия обусловлены в основном сильными и необрати­мыми ковалентными связями.

В традиционной комбинаторной химии формируется статическая смесь агрегатов фиксированного состава, и вводимый «темплет» (лиганд) отбирает самое лучшее свя­зующее вещество без увеличения его содержания. В дина­мической комбинаторной химии исходят из динамической смеси, у которой после добавления « темпл ета» изменяет­ся состав и распределение концентраций блоков, и самое лучшее связующее вещество по отношению к «темплету » будет единственным преобладающим продуктом.

В комбинаторной химии «темплетом» (или лигандом) принято считать молекулу, ион или макромолекулу, ко­торые реагируют с другими компонентами и изменяют рас­пределение концентраций продуктов системы при непре­рывно протекающих реакциях образования требуемого агрегата, макромолекулы или промежуточного продукта. Примером «темплета» является молекула ДНК, выпол­няющая функцию модели для синтеза макромолекулы типа РНК.

Самосборка в динамической комбинаторной химии обеспечивает возможность новых подходов к молекуляр­ной сборке. В течение последних лет в этой области осу­ществлено много интересных усовершенствований. В част­ности, большое развитие получил так называемый моле­кулярный докинг — процедура поиска оптимальных мест пристыковки малых молекул лиганда (биологически ак­тивного вещества) к белковой макромолекуле.

Динамическая комбинаторная библиотека (ДКБ) пред­ставляет собой набор промежуточных веществ, которые могут находиться в динамическом равновесии со «строи­тельными» блоками. Для описания состава ДКБ обычно используют термин «химический набор», который состо­ит из двух или более компонентов библиотеки, «строитель­ных» блоков или реагентов. Из динамической комбина­торной библиотеки отбираются «строительные» блоки со свойствами, пригодными для формирования самособираю- щихся объектов, и в присутствии «темплета» осуществ­ляется самосборка.

Компоненты ДКБ взаимодействуют посредством обра­зования слабых нековалентных связей. В принципе воз­можно создание любых обратимых сборок из этих компо­нентов. Поскольку все взаимодействия между компонен­тами являются обратимыми и равновесными, ДКБ имеет динамическую природу. Таким образом, ДКБ способна без труда реагировать на различные факторы внешнего воз­действия. В частности, количество определенных агрега­тов ДКБ может изменяться с изменением термодинами­ческих условий и в зависимости от природы «темплета», добавляемого к системе. В равновесном состоянии перед добавлением «темплета» у компонентов ДКБ имеется мно­го возможностей для взаимодействия друг с другом по­средством слабых нековалентных связей с образованием разнообразных агрегатов. После того как добавляется «темплет» к системе ДКБ, происходит перераспределение содержания промежуточных веществ. В итоге увеличит­ся и станет стабильной только концентрация тех агрега­тов или сборок, которые лучше всего соответствуют «тем- плету».

Увеличение концентрации определенного промежу­точного продукта может произойти только вследствие об­ратимого сдвига остальных реакций в направлении обра­зования этого продукта, если только это диктуется равно­весными условиями (достижением минимума энергии и максимума энтропии). Следовательно, система стремится обеспечить сборку наиболее стабильными связями с «тем- плетом», а концентрация нестабильных сборок при этом уменьшается. В то же время компоненты ДКБ могут взаи­модействовать друг с другом спонтанно, производя боль­шое количество разнообразных агрегатов с различной фор­мой и свойствами.

Имеется много факторов, которые влияют на эффек­тивность ДКБ. К ним относятся:

1. Природа компонентов и «темплетов» ДКБ. Необ­ходимо, чтобы выбранные компоненты имели подходящие функциональные группы. Чем больше разнообразие этих групп в компонентах, тем большей вариативности можно достигнуть при разработке систем (см. рис. 6.17). Кроме того, свойства этих групп должны быть совместимыми со свойствами « темплета».

2. Типы межмолекулярных взаимодействий в ДКБ. Для того чтобы с помощью вычислительной химии можно было предсказать возможность образования молекулярных агрегатов, необходимо априори знать о межмолекулярных взаимодействиях между компонентами и механизме ассо­циации компонента с «темплетом». В ДКБ межмолекуляр­ные взаимодействия должны иметь нековалентный харак­тер, что приводит к обратимости превращений, происхо­дящих между компонентами ДКБ. Такие взаимодействия способствуют быстрому установлению равновесия, так что можно проверить все имеющиеся возможности образова­ния молекулярных агрегатов.

3. Термодинамические условия. Растворимость компо­нентов, «темплетов» и получаемых молекулярных агре­гатов в растворителе (среде ДКБ) может сильно зависеть от равновесных термодинамических условий. Для повы­шения эффективности ДКБ растворимость компонентов в среде не должна значительно отличаться от растворимо­сти «темплета». В водной среде недостаточная раствори­мость «темплета» является проблемой главным образом при использовании белка в его качестве, аналогичную про­блему могут создавать также и нуклеиновые кислоты. Об­разование нерастворимого молекулярного агрегата сдви­гает равновесие в направлении образования этого агрега­та как продукта реакции. Условия протекания реакций, представленных в ДКБ, должны быть по возможности мягкими, чтобы свести к минимуму вероятность появле­ния несовместимости, неизбежной в процессах обмена и распознавания.

2. Методы анализа. В ДКБ при определенных обстоя­тельствах должна существовать возможность для прекра­щения проводимых реакций, чтобы можно было перемес­тить систему из динамического в статическое состояние. Прекращение реакций позволяет «отключить» систему от синтеза после добавления «темплета» и образования луч­шего из возможных сшивающих реагентов. В этом случае система приходит в равновесное состояние и распределе­ние молекулярных агрегатов сохраняется постоянным для возможности проведения анализа.

Иногда упрощение процесса самосборки может быть достигнуто путем анализа на стадии распознавания. Мо­лекулярное распознавание представляет собой специфи­ческую идентификацию путем взаимодействия одной мо­лекулы с другой.

Особенность распознавания молекул ДКБ заключает­ся в выборе рецептора, наиболее подходящего для данно­го «темплета». Это способствует разработке эволюцион­ного подхода для получения и селективного отбора наибо­лее подходящих рецепторов, подобного эволюционному развитию природы. Направленная эволюция высокоаф­финных лигандов для биомолекул в недавно возникшей области комбинаторной химии, называемой динамиче­ской вариативностью, может широко применяться при са­мосборке.

Существуют два принципиальных подхода в процессе распознавания молекул: формообразование и формование (см. рис. 6.18).

При «формообразовании» создаваемый молекуляр­ный агрегат из библиотеки соединений принимает форму

пустоты, ограниченной «темп летом». Свободное простран­ство внутри «темплета» выполняет функцию слепка и мес­та, где происходит соединение компонентов библиотеки и образуются агрегаты. При «формовании» происходит не­посредственное соединение компонентов динамической библиотеки с помощью «темплетов».

Для самосборки, образования рецептора и распозна­вания молекул применяют огромное количество молекул. Такие «распознающие» молекулы могут содержать рецеп­торы для распознавания кислотных карбоксильных, пеп­тидных, углеводных и других групп.

Молекулярные рецепторы — это концептуально про­стейшие объекты супрамолекулярной химии, хотя струк­тура их далеко не всегда проста. Их функция — «нахо­дить» нужный субстрат среди подобных и селективно, т. е. избирательно связывать его. Селективность молекуляр­ного распознавания достигается, если наряду с компле­ментарностью рецептора и субстрата между ними есть сильное суммарное связывание, возникающее благодаря множественному взаимодействию нескольких центров связывания. Необходимое условие такого взаимодейст­вия — большая площадь контакта рецептора и субстрата.

Имеются специальные методы и реагенты для конст­руирования циклических, контейнерных или линейных самособирающихся структур (или комплексов) в качест­ве рецепторов и для идентификации молекул. Например, стратегия построения циклической структуры заключа­ется в использовании тройных и комплементарных водо­родных связей между донор-донор-акцепторной группой одной молекулы и акцептор-акцептор-донорной группой другой молекулы.

Методы «контейнерной» супрамолекулярной химии также можно использовать для конструирования макро­молекул, восприимчивых к распознаванию молекул и об­разованию специфических связей. В этих методах внутрен­няя поверхность конструируемой молекулы (« хозяина » или рецептора) взаимодействует с поверхностью «гостя», или лиганда, а энергия слабых связей, образующихся между ними, определяет степень прочности специфического свя­зывания и возможность распознавания молекул.

После завершения самосборки компонентов образую­щийся «хозяин» принимает индивидуальную простран­ственную конформацию, часто с пустотой или щелью для полного или частичного заключения в нее молекулы «гос­тя» . Хотя контроль над разработкой технологии и специ­фичность распознавания в этих методах не столь сущест­венны, как в динамической комбинаторной библиотеке, во многих случаях ограничений и затруднений при разра­ботке меньше, чем в системах динамических комбинатор­ных библиотек.

Illlilllllllllllllllllllllilllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll^