Динамика микрофлоры[16]

К концу первого периода (стадия формирования устойчивого микробиоценоза) наблюдений (5-й отбор - окт. 2006 г.) после отмеченного всплеска летней активности микрофлоры (июнь 2006 г.) по всем вариантам (за некоторым исключением) наблюдали следующие тенденции: снижение численности аммонифицирующих микроорганизмов; снижение численности бацилл; снижение численности микроорганизмов, способных использовать минеральные формы азота; снижение численности плесневых грибов; снижение численности микроорганизмов, способных к разрушению парафинов; увеличение численности денитрифицирующей микрофлоры; увеличение численности анаэробных азотфиксаторов; увеличение уровня пероксидазной активности.

Относительно автохтонной микрофлоры наблюдали увеличение ее численности в вариантах засыпок на параллельных участках - 1.1-1.4 (I) и 2.1-2.4 (2) и преимущественное снижение их численности в вариантах залежи. На изменение численности микрофлоры различных физиологических групп и их активности безусловное влияние оказывали изменения физико-химических параметров среды обитания - за счет загрязнителя и вариации уровня влажности и кислотности.

Статистическую обработку выполняли для обнаружения связей между отдельными показателями. С этой целью анализировали наиболее значимые показатели, найденные для вариантов залежи, относящихся к завершающему этапу наблюдений (2009 г.). Связь между отдельными показателями устанавливали за счет использования программного пакета StatGra- phicx и статистических функций пакета Excel. Найденные математические зависимости лишь подтверждают имеющиеся выводы и свойственны для идентично или антибатно изменяющихся показателей.

Так, была обнаружена тесная корреляционная связь между количеством автохтонных микроорганизмов и грибов (г = +0,94), а также между количеством автохтонных микроорганизмов и микроорганизмов, разрушающих парафины (г = +0,71).

Изменение активности фермента пероксидазы в значительной степени определяют парафиноразрушающие микроорганизмы, что описывается уравнением регрессии с коэффициентом корреляции г = +0,91. Также наблюдается связь активности пероксидазы и OBK (окислительновосстановительный коэффициент), определяя фактически общую направленность процессов распада и синтеза как присущих торфянику соединений, так и привнесенных в него (г = +0,66).

Следует отметить, что при рассмотрении результатов конечного этапа наблюдений достоверных связей между отдельными представителями азоттрансформирующего микробиоценоза выявить не удалось, однако определенные тенденции наблюдали.

Констатация изменения численности микрофлоры или показателей, характеризующих ту или иную сторону ее активности, в конце каждого или даже последнего периода наблюдений вряд ли является основополагающей для полноценного установления влияния нефтезагрязнения на микрофлору торфяного болота. Дело в том, что кратковременные флуктуации численности микрофлоры могут возникнуть даже в течение нескольких часов, поэтому более или менее реальную картину влияния уровня нефтезагрязнения на микробиоценоз торфяника можно получить путем сравнительной оценки средних значений, выявленных для каждого показателя за год наблюдений.

Годичный период наблюдений показал, что наименьшая численность аммонифицирующих микроорганизмов была обнаружена в вариантах засыпок, располагающихся на обоих участках с повышенными дозами нефтезагрязнения (10 и 15 л/м2). В то же время в залежи численность микроорганизмов этой группы увеличивалась с повышением концентрации нефтезагрязнения (особенно четко на участке I). Последнее можно связать с тем, что в торфяных почвах с устоявшимся динамическим равновесием аммонифицирующая микрофлора развивается очень неактивно, в то же время побудительным фактором ее развития может стать введение дополнительных источников питания (в том числе нефтяного загрязнения). На развитие аммонификаторов эффективное воздействие оказало изменение влажности, связь достоверно положительная (г = +0,62).

Споровые бактерии (бациллы) способны к трансформации тех же соединений, что и аммонифицирующая микрофлора. Фактически, это часть аммонификаторов, способная образовывать споры для выживания в экстремальных условиях, поэтому между численностью бацилл и влажностью торфяной почвы связь достоверно отрицательная (г = -0,49). Годичный период наблюдений за микроорганизмами этой группы показал, что их реакция была крайне неоднозначной. Так, количество бацилл в засыпке оказалось наибольшим при низком уровне нефтезагрязнения (3 л/м2), но только на участке I, а в залежи наблюдали тенденцию увеличения их численности при повышении нефтезагрязнения. Тем не менее при уровне нефтезагрязнения 15 л/м2 количество бацилл в залежи не оказалось высоким. Следовательно, аммонифицирующая микрофлора на площадках с повышенным нефтезагрязнением оказалась довольно устойчивой, именно поэтому в них и не наблюдали высокого содержания бацилл по сравнению с вегетативными клетками аммонификаторов. Достоверная корреляционная связь между численностью аммонификаторов и бацилл (при сравнении вариантов засыпок и залежей) описывается экспоненциальным уравнением регрессии (R = 0,53).

В целом для микроорганизмов, способных использовать минеральные формы азота (иммобилизаторов этого элемента), обнаружили те же, что и для аммонификаторов, зависимости развития от концентрации нефтеза- грязнения. При этом связь с изменением уровня влажности, как и в случае с аммонификаторами, была достоверной (R = 0,80), подчиняясь экспоненциальному закону.

Численность микроорганизмов, способных использовать минеральные формы азота, в засыпках уменьшалась при повышении уровня нефте- загрязнения (исключение - вариант с уровнем нефтезагрязнения 3 л/м2 на участке 2), а в залежи - обратная зависимость (повышение численности, хотя и неравномерное). Вообще аммонификаторы и микроорганизмы, способные использовать минеральные формы азота - спутники, так как активная жизнедеятельность аммонифицирующего микробиоценоза обычно сопровождается активизацией микроорганизмов-иммобилизаторов.

Наряду с микрофлорой, закрепляющей азот, в торфяной почве (особенно при повышенной влажности и недостатке кислородообеспечения) развивается денитрифицирующая микрофлора, благодаря которой почвы активно теряют азот в аммиачной и молекулярной формах. Несмотря на конкурентные взаимоотношения связь между численностью обеих групп достоверная (R = 0,57) и описывается линейным уравнением регрессии. Наименьшее количество микроорганизмов этой группы было обнаружено в варианте засыпки с низким уровнем нефтезагрязнения (3 л/м2), однако невысокая численность денитрификаторов была найдена и в некоторых вариантах засыпок, располагающихся на участках с повышенными концентрациями нефтезагрязнения. В залежи численность микроорганизмов этой группы оказалась наибольшей в вариантах участка 2 с высоким уровнем нефтезагрязнения (10 и 15 л/м2), на участке I подобную зависимость не обнаружили. Численность денитрификаторов в значительной степени была связана с изменением уровня влажности (г = +0,58).

Потери азота, по-видимому, компенсируются интенсивной анаэробной азотфиксацией. Во всяком случае, в вариантах участка 2 с повышенным нефтезагрязнением развитие микроорганизмов этой группы максимальное, а связь между количеством микроорганизмов этих групп достаточно тесная и описывается уравнением регрессии (г = +0,69). Кроме того, развитие анаэробных азотфиксаторов также тесно связано с изменением влажности торфяника, связь между этими показателями линейная (г = +0,74).

Таким образом, несмотря на неоднозначную реакцию азоттрансфор- мирующего микробиоценоза на различные концентрации нефтезагрязнения, следует отметить одну важную особенность: развитие большинства микроорганизмов, принадлежащих к нему, оказалось интенсивнее при повышенной концентрации нефтезагрязнения.

Относительно грибов следует отметить практически четкое понижение их численности в вариантах залежи с повышением концентрации нефтезагрязнения. При этом грибное население засыпок на участке I при повышении концентрации нефтезагрязнения также уменьшается, а на участке 2 количество грибов минимально при уровне нефтезагрязнения 5 л/м2 и максимально при высоких концентрациях нефтезагрязнения в подстилающих участках. Обнаружена отрицательная корреляционная связь (г = -0,67) между численностью грибов и влажностью изучаемых участков.

Динамика автохтонной микрофлоры в вариантах засыпок очень близка к динамике грибной, однако в залежи она неоднозначна. Наибольшая численность автохтонных микроорганизмов обнаруживается при низких уровнях загрязнения (для участка I - при 3 л/м2, для участка 2 - при 5 л/м2). На развитие микроорганизмов этой группы активное воздействие оказывала динамика влажности среды, связь между ними достоверно положительная (г = +0,74).

Представители этой физиологической группы являются резидентами почвы, поэтому их численность будет стремиться к некоей присущей данной почве величине. По-видимому, повышенный фон нефтезагрязнения является фактором, сдерживающим этот процесс. Между численностью грибного населения и численностью автохтонной микрофлоры обнаружена отрицательная корреляционная связь (г = -0,52). Отрицательный коэффициент корреляции (г= -0,64) связывает численность автохтонных микроорганизмов с ОВК, но с активностью фермента пероксидазы связь с автохтонной микрофлорой достоверно положительная (г = +0,78).

Микроорганизмы, разрушающие парафины - сборная группа, искусственно воссозданная нами на питательной среде, в которой источником углерода для тестируемой микрофлоры являются парафины - фракции нефти.

Несмотря на весьма важный тестовый характер парафиноразрушите- лей, достоверных связей между их численностью и численностью других микроорганизмов обнаружить не удалось. Однако была выявлена близкая к достоверной связь парафиноразрушающей микрофлоры с активностью фермента пероксидазы (г = +0,39), а также связь этих микроорганизмов с влажностью (г = 0,44). Скорее всего, связь сборной группы (имеющей отношение к разным физиологическим группам микрофлоры) с параллельно определяемыми показателями подчиняется более сложным законам мультирегрессии.

Таким образом, относительно углеродтрансформирующего микробиоценоза, способного к разрушению сложных полициклических соединений, к которым относятся и фракции нефти, следует отметить, что и грибы, и автохтонные микроорганизмы в вариантах залежи не обнаруживают высокой численности с повышением концентрации нефтезагрязнения. Возможно, сказывается повышенный уровень анаэробиоза, особенно неблагоприятный для грибов. Вместе с тем высокую численность демонстрируют парафиноразрушающие микроорганизмы, относящиеся к разным физиологическим группам, но одинаково использующие фракции нефти в качестве источника питания и энергии.

Активность фермента пероксидазы показывает эффективность удаления из субстрата перекисных соединений, образующихся в результате распада высокомолекулярных соединений, в том числе токсичных, а также свидетельствует о процессах распада гумусовых или гумусоподобных соединений. Сравнивая варианты засыпок, отметим, что активность данного фермента возрастает при повышении концентрации нефтезагрязнения (наблюдаемые отклонения крайне несущественны). В то же время максимум активности данного фермента наблюдали для варианта залежи с низким уровнем нефтезагрязнения - 3 л/м2, в других вариантах активность пероксидазы была практически идентична на обоих участках.

Вообще активность фермента пероксидазы обнаружила тесную достоверную взаимосвязь с показателями, вместе с нею отвечающими за трансформацию сложных циклических соединений, в том числе гумуса. Как уже было показано, положительная корреляционная связь была установлена между активностью пероксидазы и автохтонными микроорганизмами. Связь активности фермента пероксидазы с ОВК, а также с численностью грибов оказалась достоверно отрицательной (rt = -0,89 и г2 = -0,56). Близ

кая к достоверной связь была выявлена между активностью пероксидазы и численностью аммонифицирующей микрофлоры и парафиноразрушающими микроорганизмами (о последней говорилось выше).

Следует отметить высокий уровень связи активности фермента пероксидазы с влажностью (г = +0,93).

Условный коэффициент минерализации по азоту (соотношение численности амилолитических и аммонифицирующих микроорганизмов) оказался максимальным в варианте засыпки, расположенной на участке с уровнем нефтезагрязнения 3 л/м2, в залежи участка 2 - также при уровне 3 л/м2, а в залежи участка I - при уровне 5 л/м2.

Окислительно-восстановительный коэффициент (соотношение условных величин активностей оксидоредуктаз каталазы и дегидрогеназы) в вариантах засыпок дает максимальную величину при уровне нефтезагрязнения 3 л/м2 для участка I и 5 л/м2 для участка 2, а в вариантах залежи максимален при уровне нефтезагрязнения 5 л/м2.

В целом общие биологические показатели свидетельствуют о большей интенсивности процессов трансформации в вариантах засыпок и залежей при низких уровнях нефтезагрязнения (3 или 5 л/м2).

Таким образом, высокая численность микрофлоры в вариантах с повышенным уровнем нефтезагрязнения не подкрепляется интенсивностью (или напряженностью) процессов, отражающих те или иные стороны общебиологических превращений. Следовательно, процессы распада нефти в них еще могут усилиться и пройти дополнительный трансформационный цикл, прежде чем в торфянике установятся присущие ему микробный пул и уровень гомеостаза.

На втором этапе исследований в 2007-2008 гг., когда по прогнозу система восстановительных мероприятий должна начать давать реальную отдачу, был проведен скрининг микрофлоры контрольных и загрязненных участков.

К концу 2008 г. численность аммонификаторов в вариантах залежи под засыпками с уровнем нефтезагрязнения 5 и 10 л/м2 (1,36 млн/г и 1,56 млн/г соответственно) приблизилась к численности микроорганизмов этой группы в варианте опыта с чистой залежью (1,6 млн/г). Ранее подобное сближение с контрольным вариантом наблюдали при низком уровне нефтезагрязнения (3 л/м2). В то же время уровень аммонификаторов, хорошо переносящих нефтезагрязнение, остался высоким в варианте с уровнем нефтезагрязнения 15 л/м2 в залежи под засыпкой, а также во всех нефтезагрязненных вариантах, находящихся без торфяной засыпки, причем разница с контролем (чистой залежью) достигала в этот период в среднем 3 раза. Таким образом, во всех вариантах нефтезагрязненной залежи без применения засыпок, а также в варианте с уровнем нефтезагрязнения

15 л/м2 процессы рекультивации идут гораздо медленнее, что и провоцирует в конечном итоге развитие аммонификаторов.

Если в начале 2007 г. вариант с чистой залежью характеризовался самым высоким содержанием амилолитических микроорганизмов, при этом все нефтезагрязненные варианты залежи, как рекультивируемые, так и не имеющие засыпок, существенно уступали ему по численности микроорганизмов этой группы, то к концу 2008 г. численность амилолитической микрофлоры в варианте с чистой залежью оказалась сопоставима с другими вариантами и наиболее близка вариантам с низким уровнем нефтезагрязнения (5 л/м2), как с засыпкой, так и без нее.

Засыпка над чистой залежью, как и в случае с аммонификаторами, имела динамику амилолитических микроорганизмов, отличную от вариантов засыпки, расположенных над нефтезагрязненной залежью. В начале г. наибольшая численность амилолитической микрофлоры была обнаружена в вариантах засыпки над залежью с уровнем нефтезагрязнения 10 и 15 л/м2. Осенью 2008 г. численность микроорганизмов этой группы выравнялась по всем вариантам, но наиболее близким к контролю оказался вариант засыпки над залежью с уровнем нефтезагрязнения 5 л/м2.

Таким образом, амилолитическая микрофлора спустя 4 года обнаружила способность к восстановлению своей численности, приближающейся к контрольным вариантам, в вариантах с низким уровнем нефтезагрязнения.

В связи с тем что варианты с высоким уровнем нефтезагрязнения характеризуются повышенным содержанием питательных веществ, трансформируемых аммонификаторами, в том числе бациллами, имеющими прямое отношение к микроорганизмам вышерассмотренной группы, но отличающимися способностью образовывать споры, низкое содержание к концу эксперимента бацилл в варианте с уровнем нефтезагрязнения 15 л/м2 с засыпкой, а также во всех нефтезагрязненных вариантах залежи в отсутствие засыпок означает, что присутствие нефти способствует сохранению большей части аммонифицирующей микрофлоры в вегетативной форме. Обращает на себя внимание наибольшее количество бацилл в варианте с чистой залежью осенью 2008 г., а также близкие значения к контролю в вариантах - рекультивируемая залежь с 5 и 10 л/м2 нефти.

Относительно развития бацилл в различных вариантах засыпок торфяного болота в 2007-2008 гг. следует отметить неизменно низкое их содержание в варианте засыпки, располагающейся над залежью с самым высоким уровнем нефтезагрязнения 15 л/м2, что, безусловно, как и в случае с вариантами нефтезагрязненной залежи, связано с присутствием большого количества элементов питания для аммонифицирующих микроорганизмов, предпочитающих оставаться в вегетативной форме.

Итак, количество бацилл к концу эксперимента оказалось наименьшим в вариантах с повышенным уровнем нефтезагрязнения, что связано с аммонифицирующей природой жизнедеятельности этой группы, сохраняющей вегетативную форму при наличии достаточных субстратов для своего развития.

К концу эксперимента (2008 г.) количество грибов оказалось наименьшим в вариантах залежи с уровнями нефтезагрязнения 10 и 15 л/м2 (без применения торфяных засыпок). Это свидетельствует о том, что в вариантах с длительно сохраняющимся высоким уровнем загрязнения создаются условия, неблагоприятные для развития грибной флоры. Если учесть, что такие показатели, как влажность и реакция среды, на протяжении всего периода наблюдений практически не отличались от контроля в большинстве вариантов нефтезагрязненной залежи, то фактором, лимитирующим развитие грибов в ней, является, очевидно, кислородное голодание, провоцируемое сорбированной нефтью. В то же время в вариантах рекультивируемой засыпками залежи даже при высоких уровнях нефтезагрязнения наблюдается восстановление грибной флоры, причем в варианте с уровнем нефтезагрязнения 5 л/м2 их количество к концу г. превысило контрольный вариант более чем в 2 раза (630 тыс./г против 280).

Относительно развития грибов в 2008 г. в вариантах засыпок над неф- тезагрязненными участками следует отметить, что их суммарное количество (по двум отборам) отличалось следующим образом: в засыпке над чистой залежью - 610 тыс./г; в засыпке над залежью с 5 л/м2 нефти - 830; в засыпке над залежью с 10 л/м2 нефти — 620; в засыпке над залежью с 15 л/м2 нефти - 500. Таким образом, лишь в варианте засыпки над залежью с уровнем загрязнения 15 л/м2 была обнаружена меньшая по сравнению с контролем суммарная численность микроскопических грибов, что указывает на продолжающееся поступление в этот вариант токсичной для грибов нефти.

В 2007-2008 гг. динамика микроорганизмов, способных разрушать парафины, как во всех сравниваемых вариантах залежи, так и в вариантах засыпок, была, за небольшим исключением, почти идентичной. Однако разброс абсолютных величин микроорганизмов, трансформирующих парафины, был все же существенным, причем к контрольному варианту - чистой залежи - приблизились рекультивируемые варианты (с засыпками), в меньшей степени - вариант с уровнем нефтезагрязнения 10 л/м2. При этом следует отметить, что все варианты залежи без засыпок по сравнению с идентичными им вариантами с применением засыпок характеризовались гораздо меньшим содержанием микроорганизмов, способных к использованию парафинов.

В вариантах засыпок, расположенных над нефтезагрязненными участками залежи, количество парафиноразрушающих микроорганизмов в 2007-2008 гг. во всех случаях превысило контроль, что, впрочем, происходило и на более ранних этапах эксперимента. Их суммарное количество (по четырем отборам) отличалось следующим образом: в засыпке над чистой залежью - 2083 тыс./г; в засыпке над залежью с 5 л/м2 нефти - 2955; в засыпке над залежью с 10 л/м2 нефти - 3073; в засыпке над залежью с 15 л/м2 нефти - 2794.

Таким образом, роль засыпок очевидна — они, как губка, впитывают в себя нефть с адсорбированными на них парафиноразрушающими и другими микроорганизмами, которые, в свою очередь, обеспечивают эффективное разрушение поллютанта.

OBK - окислительно-восстановительный коэффициент, свидетельствующий об общем уровне процессов распада-разложения, происходящих в тестируемых субстратах.

Безусловно, что к концу эксперимента большую напряженность процессов распада-синтеза продемонстрировали все нефтезагрязненные варианты без засыпок, т. е. в данный период (осень 2008 г.) в них активизировались процессы трансформации. В варианте нефтезагрязненной залежи 15 л/м2 под засыпкой уровень OBK к концу эксперимента оставался довольно высоким по отношению к контролю, а в вариантах нефтезагрязненной залежи 5 и 10 л/м2 под засыпками процессы трансформации приближались к уровню чистой залежи. В самих засыпках, расположенных над участками залежи с уровнем нефтезагрязнения 10 и 15 л/м2, напряженность окислительно-восстановительных процессов оказалась выше, чем в засыпке над чистой залежью, и выше засыпки, загрязненной 5 л/м2 нефти.

Спустя 4 года от начала эксперимента в рекультивируемой нефтезагрязненной залежи наблюдается тенденция к восстановлению микробиологической деятельности. Прежде всего это касается вариантов с низким уровнем нефтезагрязнения. Если восстановление жизнедеятельности микрофлоры в варианте с уровнем нефтезагрязнения 3 л/м2 отмечали еще в 2007 г., то в 2008 г. такой же эффект обнаружили относительно варианта с уровнем нефтезагрязнения 5 л/м2 и частично при более высоких уровнях нефтезагрязнения.

Положительная динамика восстановления микробиологической деятельности в варианте с уровнем нефтезагрязнения 5 л/м2 наблюдается по нескольким физиологическим группам микроорганизмов: по амилолити- ческой микрофлоре, которая, иммобилизуя азот, в конечном счете способствует восстановлению растительного покрова нефтезагрязненного торфяного болота, по грибам и парафиноразрушающей группе.

Во всех вариантах нефтезагрязненной залежи без применения торфяных засыпок, а также в варианте с уровнем нефтезагрязнения 15 л/м2 с засыпкой процессы рекультивации идут гораздо медленнее, что провоцирует развитие аммонификаторов, хорошо переносящих высокий уровень нефтезагрязнения, а также бацилл, имеющих аммонифицирующую природу жизнедеятельности и сохраняющих, как большинство аммонифицирующих микроорганизмов, вегетативную форму при наличии достаточных субстратов для своего развития.

Интегральным показателем, характеризующим общую напряженность процессов распада-синтеза как в вариантах залежи, так и в вариантах засыпок, является ОВК. Высокий в сравнении с контролем уровень OBK обычно свидетельствует об активно протекающих на данный момент времени процессах окисления, а именно о том, что в субстрате присутствует большое количество неутилизированных высокомолекулярных веществ (в том числе фракций нефти), подвергаемых окислению. Данный тезис подтверждается выявлением высоких значений OBK в нерекультивируе- мых вариантах нефтезагрязненной залежи, а также в рекультивируемой залежи с повышенным уровнем нефтезагрязнения 15 л/м2. Дополнительным свидетельством эффективной работы торфяных засыпок в качестве рекультивирующей системы является обнаружение в тех из них, которые расположены над участками залежи с высоким уровнем нефтезагрязнения - 10 и 15 л/м2, более активно протекающих окислительных процессов (ОВК засыпок 10 и 15 л/м2 gt; OBK засыпки 5 л/м2 gt; OBK чистой засыпки), что указывает на существующие на данном этапе различия в скорости извлечения из залежи нефти.